COVID-19 Diagnóstico Molecular

18/08/2020

 

AGOSTO 18, 2020

 

Hasta que no se descubran y se desarrollen tratamientos y vacunas eficaces, el control de la enfermedad por SARS-CoV-2 requiere la combinación de esfuerzos individuales y poblacionales, el uso concomitante de pruebas de diagnóstico y un compromiso moral, económico y social de nuestros gobiernos.

La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es una enfermedad infecciosa causada por el virus llamado SARS-CoV-2. El período promedio de incubación del SARS-CoV-2 es de aproximadamente 5 días (rango de 2 a 14 días), seguido por el desarrollo de la sintomatología de la enfermedad aproximadamente por 12 días (rango de 8 a 16 días). La enfermedad es transmitida generalmente por personas sintomáticas, pero existe evidencias que la transmisión puede ocurrir antes de que las personas infectadas desarrollen los síntomas (presintomáticos), o por individuos infectados que nunca desarrollan los síntomas (asintomáticos) (Science. May 1, 2020).

Las pruebas de laboratorio para la enfermedad COVID-19 se pueden clasificar como pruebas de ácido nucleico o moleculares, serológicas, antigénicas y auxiliares, las cuales todas juegan diferentes papeles o roles ya sea en clínicas u hospitales, puntos de atención, o sectores específicos en la comunidad. Este artículo se enfoca en las pruebas moleculares para el diagnóstico de la infección por SARS-CoV-2.

Las pruebas moleculares para verificar la infección por SARS-CoV-2 se basan en pruebas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa - Polymerase Chain Reaction) usando transcripción inversa (RT-PCR - Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), para detectar el ARN del SARS-CoV-2 en una muestra del tracto respiratorio del paciente. La PCR es un método de laboratorio utilizado para amplificar una gran cantidad de copias de ADN a partir de una muestra muy pequeña de ADN para que pueda detectarse. El paso de transcripción inversa permite que el ARN viral se convierta en ADN para poder utilizar la técnica de PCR.

La muestra respiratoria preferida es un hisopo de la parte posterior de la nariz (hisopo nasofaríngeo). El hisopo nasofaríngeo se recolecta haciendo que el paciente incline la cabeza hacia atrás y luego se inserta suavemente el hisopo a través de una de las fosas nasales hasta que se encuentre resistencia, aproximadamente 4-5 centímetros. El hisopo se deja en ese lugar durante varios segundos, luego se gira varias veces y se retira. Este procedimiento no es doloroso, pero puede ser incómodo, causar lagrimeo y provocar un ataque de tos o estornudos. La producción potencial de tos o estornudos obliga el uso de equipo de protección por parte de la persona que toma la muestra para disminuir la posibilidad de transmisión de la infección.  Cuando no es posible recolectar un hisopo nasofaríngeo, se recomienda recolectar otras muestras del tracto respiratorio. Estas incluyen un hisopo de la parte posterior de la garganta (orofaríngeo), o un hisopo de la parte frontal de la nariz (hisopo nasal). En estos casos, se recomienda recoger ambos hisopos orofaríngeo y nasal e introducirlos en el mismo tubo de medio de transporte para aumentar las posibilidades de obtener suficiente virus para la prueba. El uso de muestra de saliva para la prueba molecular esta actualmente en investigación con resultados preliminares prometedores (medRxiv. April 22 y May 5, 2020).

 

Figura 1. La prueba de RT-PCR para COVID-19 comienza con una muestra de la nariz y garganta del individuo usando un hisopo nasofaríngeo. Una vez que se toma la muestra, el hisopo se introduce en un tubo que contiene medio de transporte viral. Esta muestra se procesa en el laboratorio para extraer el ARN viral, el cual se transcribe en ADN complementario. Luego “primers” específicos para SARS-CoV-2 se añaden al tubo de reacción, los cuales se unen al ADN y proporcionan un punto de partida para la ADN polimerasa para ayudar a copiarlo. La ADN polimerasa degrada la sonda unida, lo que da como resultado un aumento de la señal de fluorescencia a medida que se producen copias del ADN del virus. Si el nivel de fluorescencia cruza un cierto umbral, la prueba es positiva. 

 

La precisión de una prueba de diagnóstico se define principalmente por su sensibilidad (Porcentaje de pruebas positivas en pacientes con enfermedad), y especificidad (Porcentaje de pruebas negativas en individuos sanos). Las pruebas moleculares típicamente tienen alta sensibilidad analítica en circunstancias ideales. Sin embargo, en la práctica clínica, la sensibilidad de la prueba varía según la duración de la enfermedad, el síndrome clínico específico de COVID-19, el tipo de muestra respiratoria, la calidad de recolección y transporte de la muestra y la carga viral. Debido a estos factores individuales o en combinación, se han reportado tasas de resultado de falsos negativos en promedio hasta de un 30% de pacientes con COVID-19 (medRxiv. February 17, 2020) En pacientes con alta sospecha de enfermedad por COVID-19, con síntomas o hallazgos radiológicos sugestivos, o contacto documentado con la enfermedad, la prueba molecular debe ser repetida luego de un resultado inicial negativo. Dos resultados PCR negativos al menos con una diferencia de 24 horas se utiliza comúnmente como criterio para descontinuar el aislamiento de un paciente con COVID-19. Sin embargo, un número de pacientes puede volver a presentar resultados positivos de PCR luego de dos resultados negativos debido a fluctuaciones en la cantidad de virus durante la convalecencia.

El SARS-CoV-2 pertenece a la familia de los b-coronavirus y es el séptimo coronavirus que se sabe infecta a los humanos. Se han descrito varios b-coronavirus relacionados al SARS-CoV-2, incluyendo el SARS-CoV-1, un coronavirus que causó el brote de SARS en el año 2002 en China, y el MERS, un coronavirus que causó el brote del síndrome respiratorio del Medio Oriente en el 2012. Además, existen otras cepas de a y b-coronavirus (HCoV-229E, HCoV-OC43, HCoV-HKU1 y HCoV-NL63), que son responsable por una proporción alta de resfriados comunes. Debido a esto, existe la posibilidad de reactividad cruzada en pruebas de diagnóstico para COVID-19. Para mantener una especificidad alta de las pruebas diagnosticas, se recomienda que las pruebas moleculares amplifiquen distintas regiones de ARN específicas del SARS-CoV-2. Por ejemplo, en Estados Unidos la FDA y el CDC recomienda que la prueba de RT-PCR amplifique los genes de la nucleocápside viral N1, N2 y el gen RNase P (Ribonuclease P), mientras que la prueba de la OMS fue diseñada para amplificar los genes RNA-dependent RNA Polymerase (RdRP) y el de la envoltura o “Envelope” (Eurosurveillance. January 23, 2020).

Un punto importante para tener en cuenta en términos de especificidad es que las pruebas moleculares pueden detectar ARN viral que no necesariamente proviene de la replicación activa del SARS-CoV-2 (Emerging Infectious Diseases. October 2004). Una partícula completa de virus infeccioso consiste en ácido nucleico rodeado por una cápside. Se ha investigado la relación entre la detección de SARS-CoV-2 mediante pruebas moleculares y el desprendimiento de ARN viral infeccioso. Los resultados sugieren que un grupo de pacientes convalecientes con prueba molecular positiva para SARS-CoV-2 pueden desprender ARN viral que no es infeccioso. Sin embargo, la única prueba actual para descartar completamente la presencia de virus infeccioso es mediante el cultivo de partículas virales en células que permiten su crecimiento (Emerging Infectious Diseases. January 2006).

Los pacientes con enfermedad leve por COVID-19 generalmente dejan de ser infecciosos aproximadamente una semana luego del inicio de los síntomas, y en casos excepcionales pueden continuar teniendo ARN viral detectable en sus vías respiratorias durante períodos de tiempo más largos (Clin Infect Dis. 2020). Los pacientes con enfermedad severa pueden ser PCR positivos por más tiempo, a veces extendiéndose por semanas o meses. El ARN del SARS-CoV-2 también se puede encontrar en muestras de heces y, por lo general, continúa siendo detectable en las heces durante semanas. Existe evidencia que las células epiteliales intestinales humanas pueden soportar la replicación del virus (Lancet Gastroenterology Hepatology. March 19, 2020). No se ha demostrado la transmisión fecal-oral de SARS-CoV-2, pero existe la posibilidad de que el desprendimiento viral fecal pueda contribuir a la propagación de la infección.

El tiempo que toma desde la adquisición de la muestra hasta el resultado puede variar de menos de una hora a varios días. Los factores que determinan el tiempo incluyen la plataforma de la prueba, así como la logística de adquisición de muestras, transporte, procesamiento y reporte de resultados. Pruebas moleculares en laboratorios intrahospitalarios se basan en la técnica de PCR, las cuales generalmente requieren de 4 a 6 horas de procesamiento, incluyendo la preparación de la muestra, la extracción de ARN, y la fase de amplificación y transcripción inversa RT-PCR, mas la lectura del ADN amplificado. Existen pruebas de PCR en el punto de atención que pueden acortar el tiempo hasta 30 min y ocasionalmente más rápido. Esto se logra utilizando cartuchos o tecnología de flujo lateral para la preparación de la muestra, la amplificación de ácido nucleico, y la detección. Sin embargo, estas pruebas rápidas tienen un rendimiento menor y mayor costo, no son automatizadas, y lo mas importante, tienen menor sensibilidad analítica. Existen factores y circunstancias que pueden ayudar en la selección del tipo de prueba entre convencional o rápida, por ejemplo, para uso en tamizaje de poblaciones versus para uso de decisiones clínicas en el sistema hospitalario en pacientes ambulatorios o casos de emergencia como cirugías con alto riesgo de transmisión de la infección o en trasplantes.

Actualmente existen diferentes indicaciones para el uso de las pruebas diagnósticos moleculares. Debido desde el inicio a la capacidad limitada y que continua de pruebas diagnósticas se han establecido unas listas de prioridad para su uso. La prioridad 1 incluye pacientes hospitalizados y trabajadores de la salud sintomáticos. La prioridad 2 incluye pacientes sintomáticos en centros de salud, pacientes mayores de 65 años con enfermedades que predisponen al COVID-19, y paramédicos de atención de urgencias. La prioridad 3 incluye pacientes ambulatorios sintomáticos, incluidos los trabajadores de infraestructura crítica. Hasta este momento, en la mayoría de los países, las personas asintomáticas no hacen parte de la lista de prioridad para pruebas diagnosticas. Sin embargo, con el aumento de las capacidades y números de pruebas, así como los cambios sociales y laborales requeridos, se espera que el tamizaje en pacientes asintomáticos se convierta en una necesidad.  

La cuantificación del número de virus dentro de un individuo infectado puede ayudar a informar acerca del tratamiento y pronóstico. La carga viral es una expresión numérica de la cantidad de virus en un volumen dado, por ejemplo, el número de partículas infecciosas por mililitro. Estudios clínicos sugieren que la carga viral inicial en un paciente está relacionada con la gravedad de la enfermedad por COVID-19. Sin embargo, la evidencia actual de esta relación es todavía limitada debido la calidad subóptima de muchos de los estudios, su naturaleza retrospectiva, cohortes pequeñas, y el potencial de sesgo de selección. Otro factor para tener en cuenta en relación con la carga viral es el tipo de prueba usada. En general, las pruebas moleculares de PCR tienen un limite de detección que varia entre 100 a 4.000 copias de virus por mililitro de muestra. De esta forma, en muestras con cargas virales altas es posible que la mayoría de pruebas muestren resultados concordantes, mientras que en muestras con carga viral baja (pacientes presintomáticos o asintomáticos), se ha demostrado que algunas pruebas tienen menor sensibilidad. Además, pacientes de diferentes edades, incluidos los niños, pueden tener cargas virales similares, lo que aumenta la posibilidad de que los niños pueden ser infecciosos a pesar de mostrar síntomas menos severos que los adultos. En este momento se requiere mayor investigación para poder correlacionar cargas virales de SARS-CoV-2 con síntomas, capacidad de contagio, tratamiento y pronóstico de la enfermedad.

Un punto importante acerca de la sensibilidad de las pruebas moleculares en relación con la carga viral es el interés en desarrollar pruebas usando una técnica de "agrupación o Pooling" de muestras, para aumentar el rendimiento de las mismas. Esta técnica permite que un laboratorio mezcle varias muestras en un "lote" o muestra agrupada y luego analice la muestra agrupada con una prueba única de diagnóstico. Por ejemplo, esto permitiría analizar cuatro muestras juntas, utilizando solo los recursos necesarios para una sola prueba. Si la muestra agrupada es negativa, se puede deducir que todos los pacientes fueron negativos. Si la muestra agrupada resulta positiva, entonces cada muestra debe analizarse individualmente para determinar cuál fue positiva. Debido a que las muestras se agrupan, en última instancia, se realizan menos pruebas en general, lo que significa que se utilizan menos suministros de prueba, y los resultados pueden ser entregados a los pacientes más rápidamente en la mayoría de los casos. Sin embargo, debido a que las muestras están diluidas, lo que podría dar como resultado una menor carga viral disponible para detectar, y por lo tanto existe una mayor probabilidad de que se den resultados falsos negativos, particularmente si no se validan adecuadamente. Este método funciona bien cuando hay una baja prevalencia de casos, lo que significa que se esperan más resultados negativos. Dado que evaluar a individuos asintomáticos significa evaluar a un mayor volumen de pacientes, y una baja prevalencia puede ser más probable en una población asintomática, particularmente si la población tiene un bajo riesgo de contraer el SARS-CoV-2, es posible que el uso de estas técnicas de agrupación sean una solución económica y eficiente para la detección de la infección en pacientes asintomáticos.

Para concluir, en mi opinión es que el siguiente paso para el control de la enfermedad requiere pruebas diagnósticas moleculares precisas que se lleven a cabo de manera amplia y repetida. La masificación de estas pruebas produce consecuencias favorables para las personas, las comunidades y la población en general. Estas pruebas no sólo permiten la identificación, aislamiento, tratamiento de individuos infectados y el rastreo de contactos, sino también el diagnóstico de pacientes durante la fase presintomática y portadores de la infección (asintomáticos). El uso masivo de pruebas diagnósticas permite definir con mayor precisión las tasas de infección y contagio en diferentes regiones de un país. Un número limitado de pruebas diagnosticas es “imperdonable” porque inhibe la capacidad de los gobiernos de entender la evolución de la enfermedad para hacer planes de inversión y asignación de recursos que permitan aumentar la probabilidad de sobrevivencia de sus habitantes.

Hasta que no se descubran y se desarrollen tratamientos y vacunas eficaces, el control de la enfermedad por SARS-CoV-2 requiere la combinación de esfuerzos individuales y poblacionales, el uso concomitante de pruebas de diagnóstico y un compromiso moral, económico y social de nuestros gobiernos. En el área científica y médica nos hemos preparado toda una vida para un momento come este. En el campo de laboratorio clínico se producirán avances que permitirán seguir aplicando métodos mas sencillos, precisos y eficaces para el diagnóstico y manejo de la enfermedad…seguiremos trabajando hora tras hora con esos objetivos en mente.

 

Julio Delgado, MD

Profesor de Patología y Jefe de la División de Patología Clínica,

Escuela de Medicina de la Universidad de Utah.

Director Médico de ARUP Laboratories

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